• معرفی پرایمر در سیستم همانندسازی

همانندسازی ژنوم فرایندی است که طی آن ماده وراثتی دو برابر می شود. به طور کلی برای همانندسازی سه سوبسترا اصلی باید وجود داشته باشد، نوکلئوتیدهای تری فسفاته، الگوی تک رشته ای و پرایمر. بعد از فراهم شدن سوبسترای لازم برای همانندسازی، حال به آنزیمی برای پلیمریزاسیون DNA نیاز داریم. این وظیفه بر عهده DNAپلیمراز (DNA pol) است. آنزیم های DNA pol آنزیم هایی هستند که نوکلئوتیدهای تری فسفاته را به نوکیئوتیدهای مونوفسفاته تبدیل نموده و بر اساس مکمل بودن بازها، آن ها را در مقابل رشته الگو قرار داده و سپس نوکلئوتید جدید را از طریق یک پیوند فسفودی استر به آخرین نوکلئوتید موجود در رشته در حال سنتز اضافه می نماید. آنزیم های DNA pol وابسته به الگو، نمی توانند سنتز DNA را روی مولکولی که کاملا تک رشته ای است شروع کنند لذا به یک انتهای 3`OH آزاد برای شروع پلیمریزاسیون نیازمندند. نوکلئوتید جدید از انتهای 5`P خود به 3`OH متصل می گردد، با توجه به این موضوع همواره پلیمریزاسیون در جهت 5` به 3` انجام می پذیرد. یک سری واکنش های آغازکننده، این سر 3`OH یا سر نخ دیگری را در اختیار آنزیم DNA pol قرار می دهند.

• معرفی تکنیک PCR

وجه تسمیه نام گذاری به عنوان واکنش زنجیره ای پلیمراز (Polymerase Chain Reaction) این است که آنزیم پلیمراز را به تعداد حدودا 40 بار (بسته به تعداد سیکل) و به صورت متوالی مجبور به فعالیت می کنیم.PCR در واقع شبیه سازی همانندسازی طبیعی DNA می باشد به این صورت که PCR با استفاده از اجزای همانندسازی طبیعی DNA، اما داخل لوله آزمایش DNA را تکثیر می نماید. در یک سلول زنده همانندسازی ژنوم در یک فرایند بسیار پیچیده با دخالت چند آنزیم مختلف از جمله توپوایزومراز و هلیکاز و ... صورت می گیرد در صورتی که در PCR تنها به وسیله آنزیم پلیمراز و گرم کردن و سرد کردن های متوالی توسط دستگاه ترموسایکلر انجام می گیرد. DNA به حرارت مقاوم است و تنها اتفاقی که در مواجهه با حرارت برایش می افتد دناتوراسیون است که آن هم با رناتوراسیون به حالت اولیه باز می گردد.
در ساده ترین تعریف برای مراحل همانندسازی، DNA دو رشته ای از هم باز می شود و هر رشته از مولکول اولیه به عنوان الگوی ساخت یک رشته مکمل جدید استفاده می شود. این مرحله تکثیر بر توانایی نوکلئوتیدها برای جفت شدن با باز مقابل خود بر اساس قوانین واتسون - کریک استوار است، همیشه A با T و C با G جفت می شود، بنابراین رشته الگو توالی بازی رشته مقابل را تعیین می کند.

• کاربرد تکنیک PCR

پیش از معرفی تکنیک PCR توسط Kary Mullis در سال 1983، تکثیر DNA از طریق کلون سازی امکان پذیر بود. در کلون کردن ژن ها، یک قطعه DNA با استفاده از لیگاز به یک حامل کلون سازی متصل و با آن درون یک سلول میزبان از قبیل باکتری E.Coli وارد می شود. هم زمان با رشد باکتری، مولکول DNA نوترکیب از طریق سیستم همانندسازی آن تکثیر می شود. پس از اینکه تعداد سلول ها به اندازه کافی رسید می توان DNA نوترکیب را تخلیص کرد. اما این پروسه چندین روز به طول می انجامد در مقابل PCR که در عرض چند ساعت و Real Time PCR که در حدود یک ساعت زمان می برد. بنابراین در موارد متعددی تکثیر از طریق PCR جایگزین کلون سازی شده است اما نه در همه موارد به عنوان مثال در PCR حتما باید توالی نوکلئوتیدی قطعه مورد نظر را بدانیم پس نمی تواند برای بررسی ژن های جدید به کار رود. هم چنین، PCR در اندازه طول قطعه ای که توانایی تکثیر آن را دارد نیز محدودیت دارد، حتی با پروتکل های بهینه شده ای مانند Long-Range PCR حداکثر طول قطعه تولیدی بیشتر از 40 Kbp نخواهد بود. در کلون سازی نیز در برخی وکتورهای اولیه همچون پلازمیدها و باکتریوفاژها، محدودیت هایی از منظر طول قطعه DNAای که می تواند درون آنها قرار داده شود وجود داشت. در وکتورهای نسل بعد که کازمیدها بودند می توانستند قطعاتی در حدود 50 Kbp را درون خود جای دهند. توسعه (Bacterial Artificial Chromosome) BACs و Yeast artificial chromosomes (YACs) کلون سازی قطعات DNA با اندازه 300 Kbp تا 1000 Kbp را امکان پذیر ساخت.

PCRنگرش ما را نسبت به تحقیقات در زمینه های علوم پایه و پزشکی، آزمایشات جنایی و تحقیقات زیست محیطی متحول کرده است. از جمله این تحولات می توان به موارد کاربرد در آزمایشگاه های بالینی جهت شناسایی بیماری های عفونی به طور سریع قبل از اینکه شواهدی همچون پاسخ آنتی بادی مشاهده شود، حساس و بدون نیاز به کشت و همچنین آزمایشگاه های تشخیص ژنتیک که در آنها سرعت و دقت عوامل تعیین کننده هستند، اشاره کرد.

تهیه نسخه های متعدد از یک ژن به منظور بررسی حضور و یا عدم حضور یک ژن، تشخیص بیماری ها قبل از تولد، تعیین جنسیت جنین، تشخیص بیماری های ژنتیکی، عفونی و سرطان، پیش بینی استعداد ابتلا به بیماری، مطالعه مقادیر اندک DNA، تکثیر RNA، مقایسه ژنوم های مختلف، تعیین ابوت و ... از جمله دیگر کاربردهای این تکنیک هستند.